Modkit pile up Inconsistent biological results for RNA m5c
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評価
- 難易度
- 4/5
- 見積もり時間
- 3〜5日
- 初心者へのやさしさ
- 35/100
- issue の種類
- バグ
- 明瞭さ
- 説明が足りない
- 活発さ
- 静か
- 領域
- bioinformatics, cli
調査の方向性
Start with the modkit pileup and dmr pair commands in the report, then inspect the referenced pileup and DMR log files alongside the threshold and coverage options. Compare the control and NSUN2 KD inputs and the resulting stoichiometry and differential calls; the issue is done when the cause of the unexpected KD results is identified or a reproducible modkit problem is isolated.
索引モデルが issue の本文から書いたものです。
説明
Hi everyone,
first time posting an issue. First thank you for having developed and keeping updating modkit, extremely useful for my research. Indeed, I am interested in RNA m5c methylation. I have ONT generated data from 2 cell lines, namely a control condition and a line knockdown (KD) for NSUN2, a major m5c methylator. In particular I added the latter as negative and quality control, to be sure that the called m5c sites disappeared upon NSUN2 KD. I have used the following lined of codes for modkit pileup
$modkit pileup
-t "${SLURM_CPUS_PER_TASK}"
--filter-threshold 0.8
--mod-threshold C:0.99
--modified-bases C:m
--reference "$REF" \ # alignment to genome
"${input_bam}"
"${output_dir}/${sample_name}.raw.bed"
--log-filepath "${output_dir}/${sample_name}.pileup.log"
Then I use an inhouse R script for differential methylation analysis as well as modkit dmr pair with the following commands
$modkit dmr pair
-a "$STG/Pilot_sample1/Pilot_sample1.raw.bed.gz" . # a CTRL condition
-a "$STG/Pilot_sample2/Pilot_sample2.raw.bed.gz"
-b "$STG/Pilot_sample5/Pilot_sample5.raw.bed.gz" \ # B NSUN2 KD
-b "$STG/Pilot_sample6/Pilot_sample6.raw.bed.gz"
--ref "$REF"
--base C
--single-code m
--cap-coverages
--min-valid-coverage 20
--header
-o "$DMR/control_vs_siNSUN2.dmr.bed"
--log-filepath "$DMR/control_vs_siNSUN2.dmr.log"
-t "${SLURM_CPUS_PER_TASK}"
I have been trying with multiple combination of thresholds but I keep getting thos kinds of results (the plot shows the significantly differentially methylated m5c sites between NSUN2 KD vs CTRL plotted according to the stoichiometry in the CTRL condition). From the biological perspective, It unlikely that I have more site in the NSUN2 KD condition, so I don t know what could have gone wrong (biologically I am sure of the knockdown of the protein, checked by different other analysis).
Could you help me? Thanks
Marcello
- 主要言語
- Rust
- スター
- 274
- フォーク
- 33
- PR マージ指標
- 30日以内にマージされた PR はありません
環境構築
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